折射率作為制藥中液體的質(zhì)量控制指標(biāo)

本文介紹了采用四種分析系統(tǒng)（pH、電導(dǎo)率、滲透壓和折光率）對(duì)九種緩沖液進(jìn)行分析案例比較。

介紹

制藥產(chǎn)品的研發(fā)和制造涉及的復(fù)雜過(guò)程需要先進(jìn)的過(guò)程分析技術(shù)，即使是常規(guī)應(yīng)用。此要求適用于不銹鋼和玻璃容器中的大規(guī)模制造工藝以及一次性袋子系統(tǒng)。從培養(yǎng)基和緩沖液制備到滅菌和去污染物的過(guò)程都需要液體化學(xué)濃度、溫度監(jiān)測(cè)和控制，以確保最佳的工藝性能。任何這些步驟的錯(cuò)誤都可能導(dǎo)致昂貴的產(chǎn)品損失、產(chǎn)品質(zhì)量下降或時(shí)間和勞動(dòng)力損失。然而，雖然任何制藥生產(chǎn)過(guò)程中的每一步都代表著代價(jià)高昂的潛在錯(cuò)誤的來(lái)源，但大多數(shù)步驟也可以用作潛在的質(zhì)量控制點(diǎn)。因此，密切監(jiān)控制造過(guò)程中的關(guān)鍵步驟是良好制造工藝設(shè)計(jì)的關(guān)鍵部分。

對(duì)液體化學(xué)品進(jìn)行有意義的質(zhì)量控制需要可靠、易于使用、高精度和快速響應(yīng)時(shí)間的分析儀器。目前滿足這些要求的在線方法包括pH、電導(dǎo)率和滲透濃度。簡(jiǎn)而言之，滲透壓濃度是溶質(zhì)濃度的量度，定義為每升溶液中溶質(zhì)的滲透摩爾數(shù)。所有這些可用技術(shù)都面臨著動(dòng)態(tài)范圍、線性度、精度以及檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）的限制。此外，這些方法都不是液體化學(xué)濃度的必不_可少的測(cè)量。在這里介紹的工作中，介紹了一種基于折射率（IoR）的新儀器，并與pH，電導(dǎo)率和滲透濃度進(jìn)行了比較。由于作為濃度監(jiān)測(cè)器的導(dǎo)電性特別高，因此要特別注意比較IoR和電導(dǎo)率測(cè)量結(jié)果。

折射率測(cè)量比pH和電導(dǎo)率具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)?/span>IoR是化學(xué)濃度的直接測(cè)量值，而pH和電導(dǎo)率取決于流體的電_子特性。因此，根據(jù)定義是化學(xué)濃度的間接或推斷測(cè)量。在制藥生產(chǎn)中，IoR可用于上游和下游應(yīng)用，而此處介紹的結(jié)果主要集中在下游緩沖液制備應(yīng)用中。傳統(tǒng)的折光儀通過(guò)將單一波長(zhǎng)的可見(jiàn)光照射到與被分析流體接觸的棱鏡上來(lái)工作。流體的loR是使用斯涅爾定律從臨界角確定的。對(duì)于大多數(shù)液體，簡(jiǎn)單的校準(zhǔn)將loR值轉(zhuǎn)換為以ppm或重量%為單位的化學(xué)濃度。傳統(tǒng)折光儀的局限性在于它們?cè)谕干淠Ｊ较鹿ぷ鳎渲泄馔ㄟ^(guò)流體傳播到光學(xué)光檢測(cè)器。這種方法的缺點(diǎn)是光信號(hào)受到流體的衍射和吸收效應(yīng)的影響。本研究中使用的IoR分析儀在反射模式光學(xué)幾何下運(yùn)行。這意味著光從光學(xué)窗口的背面（與被分析的流體接觸）反射到光學(xué)光檢測(cè)器中。通過(guò)這種方式，減輕了濁度、衍射和吸收的德羅加-托里流體效應(yīng)，并且可以方便地測(cè)量不透明流體的濃度。

雖然任何制藥過(guò)程中的每一步都代表了代價(jià)高昂的錯(cuò)誤的潛在來(lái)源，但大多數(shù)步驟也可以用作潛在的質(zhì)量控制點(diǎn)。

為了探索IoR作為質(zhì)量控制指標(biāo)的有效性，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，涉及測(cè)量已知濃度的常用緩沖液成分和溶解在水中的細(xì)胞培養(yǎng)基成分。將 IoR 測(cè)量值與 pH 值、電導(dǎo)率和滲透濃度測(cè)量值進(jìn)行比較。從這些實(shí)驗(yàn)中確定，通過(guò)IoR測(cè)量在準(zhǔn)確性，精密度，線性，可檢測(cè)極限（LOD）和定量限（LOQ）方面提供的數(shù)據(jù)優(yōu)于當(dāng)前測(cè)量溶液電導(dǎo)率，pH和滲透壓的方法。LOD被定義為與空白值（一西格瑪）相比可以測(cè)量的物質(zhì)的最_低濃度。在這項(xiàng)研究中，LOQ與LOD的區(qū)別在于，在十西格瑪的可靠性下可以確定的最_低濃度。

實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)pH、電導(dǎo)率、滲透濃度和折射率（IoR）進(jìn)行了比較，以確定常規(guī)液體化學(xué)濃度測(cè)量的最佳方法。測(cè)量是在紐約錫拉丘茲工廠進(jìn)行的。pH、電導(dǎo)率和IoR測(cè)量都是在線實(shí)時(shí)進(jìn)行的。使用離線取樣進(jìn)行滲透壓濃度測(cè)量。電導(dǎo)率、pH和滲透壓濃度是根據(jù)其在行業(yè)中的常見(jiàn)用途選擇的，并作為IoR分析儀的基準(zhǔn)。

每種技術(shù)在不同的操作原理下運(yùn)行。電導(dǎo)率是電解液或水溶液中每單位距離電導(dǎo)率的測(cè)量值，其測(cè)量低導(dǎo)電性或非導(dǎo)電性液體的能力受限。溶液的pH值是溶劑化氫離子（H+）活性的量度。滲透壓濃度是每升溶液的滲透摩爾數(shù)。這里使用的具體方法是“冰點(diǎn)降低"滲透濃度，其中冰點(diǎn)的差異作為添加到溶劑中的溶質(zhì)的函數(shù)產(chǎn)生溶液的濃度值。冰點(diǎn)降低滲透壓濃度作為一種響應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)的離線實(shí)驗(yàn)室技術(shù)受限。

折射率是一種光學(xué)技術(shù)，是溶液濃度的直接測(cè)量。本研究中使用的IoR裝置在反射幾何測(cè)量中運(yùn)行;這意味著光從光學(xué)窗口的背面反射出來(lái)，在分析下與溶液接觸并進(jìn)入光電探測(cè)器。這種幾何形狀的優(yōu)勢(shì)是，IoR分析儀可以監(jiān)測(cè)溶液的電子密度，而不會(huì)受到濁度、衍射和吸收等其他光學(xué)效應(yīng)的干擾。此外，IoR 儀器在單個(gè)探頭中包括溫度測(cè)量，從而提供兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)（濃度和溫度）的測(cè)量。

IoR、電導(dǎo)率和pH測(cè)量是連續(xù)進(jìn)行的。將pH和電導(dǎo)率探頭放置在流體池中，緩沖化學(xué)品在閉環(huán)中循環(huán)。滲透壓濃度測(cè)量是離線進(jìn)行的。制藥生產(chǎn)中使用的緩沖液組分被連續(xù)添加到各種溶液中。對(duì)于溶質(zhì)的每次增量添加，將折射率的測(cè)量值與電導(dǎo)率的測(cè)量值進(jìn)行比較，并比較兩種測(cè)量方法的數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，精密度和線性。文中使用的緩沖成分包括添加劑1。氯化鈉加入含有固定濃度磷酸鈉的溶液中，2.檸檬酸鈉加入到固定濃度的磷酸單鈉溶液中，3.磷酸單鈉添加到氯化鈉中，4.檸檬酸鈉加入磷酸鈉，5.HEPES添加到氯化鈉中，6.將聚山梨酯80加到水中，7.將Triton X-100加到水中。HEPES，4-羥_乙_基哌_(dá)嗪乙磺酸，是一種廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)的有機(jī)化學(xué)緩沖劑。選擇這七種緩沖劑是為了更好地代表傳統(tǒng)的鹽緩沖劑和預(yù)計(jì)將在下游過(guò)程中實(shí)現(xiàn)越來(lái)越多的使用的更新緩沖劑。對(duì)pH值為7的50mM（mM=milliMolar）HEPES溶液進(jìn)行了檢測(cè)極限（LOD）和定量極限（LOQ）測(cè)量，其中逐漸加入等分的氯化鈉。在這些實(shí)驗(yàn)中，IoR與電導(dǎo)率、pH值和滲透濃度進(jìn)行了比較。LOD和LOQ值是根據(jù)響應(yīng)的方均差和每個(gè)儀器響應(yīng)的斜率作為濃度變化的函數(shù)計(jì)算的。在一組單獨(dú)的培養(yǎng)基制備實(shí)驗(yàn)中，分析了幾種化學(xué)物質(zhì)，比較IoR儀器和電導(dǎo)率。其中包括HAM F10、Dulbecco MEM、RPMI 1640、酵母提取物和其他培養(yǎng)基化學(xué)品。

圖1.折射率分析系統(tǒng)。分析儀傳感器頭包含一個(gè)小型化的光學(xué)傳感器，該傳感器與所分析的液體化學(xué)品接觸。

結(jié)果解析

圖1是這些研究中使用的IoR分析儀的圖像。分析儀由兩個(gè)流體單元（一個(gè)流體單元用于冗余）和數(shù)字控制電子設(shè)備組成。流體池包含一個(gè)小型化的IoR傳感器和熱電偶，與所分析的液體化學(xué)品接觸。數(shù)字電子盒對(duì)原始光信號(hào)、IoR 的實(shí)時(shí)溫度濃度進(jìn)行分析，并輸出 IoR 或液體化學(xué)濃度。圖2至圖5是代表本文研究的所有緩沖液制備過(guò)程的結(jié)果的數(shù)據(jù)圖表。圖2顯示了本研究中為混合緩沖鹽溶液而獲得的典型數(shù)據(jù)示例。圖中，pH、電導(dǎo)率和IoR與NaPO4（磷酸鈉）濃度的關(guān)系圖。通過(guò)將 20 mM 的 NaPO4 加標(biāo)添加到 1 升 NaCl（鈉溶液）中 10 次以達(dá)到氯化鈉中 200 mM 磷酸單鈉的總濃度來(lái)進(jìn)行測(cè)量。pH值對(duì)NaPO4濃度變化的響應(yīng)不足。電導(dǎo)率和IoR均對(duì)NaPO4濃度變化表現(xiàn)出出色的響應(yīng)。與其他緩沖液化學(xué)品一樣，IoR表現(xiàn)出比電導(dǎo)率更高的線性度，并且與電導(dǎo)率的R2值0.98相比，最小二乘（R2）擬合置信度為1.00。在所有測(cè)試的緩沖溶液中，IoR 的線性度都較高。

圖2.顯示了折射率（右側(cè)縱軸）以及電導(dǎo)率和pH值（左側(cè)縱軸）與磷酸鈉濃度（以mM為單位）的關(guān)系。將10個(gè)20mM磷酸鈉濃度加標(biāo)到1L氯化鈉溶液中。

圖 3 顯示了 pH 值、電導(dǎo)率和 IoR 與 HEPES 濃度的函數(shù)關(guān)系。pH和電導(dǎo)率都不能有效地監(jiān)測(cè)HEPES濃度。電導(dǎo)率數(shù)據(jù)與HEPES濃度呈線性關(guān)系;但是，斜率為負(fù)。為了獲得適當(dāng)?shù)碾妼?dǎo)率響應(yīng)，電導(dǎo)率應(yīng)隨著HEPES濃度的增加而增加。負(fù)斜率可以解釋為，隨著HEPES濃度的增加，溶液的離子變得越來(lái)越少，因此電導(dǎo)率降低。對(duì)于適當(dāng)?shù)臐舛软憫?yīng)，人們可以預(yù)期隨著HEPES濃度的增加，電導(dǎo)率值也會(huì)增加，就像圖2中的鹽溶液一樣。因此，電導(dǎo)率無(wú)法測(cè)量HEPES濃度，因?yàn)?/span>HEPES是一種非離子溶液，電導(dǎo)率探頭在整個(gè)HEPES濃度范圍內(nèi)提供了錯(cuò)誤的HEPES濃度讀數(shù)。電導(dǎo)率也無(wú)法測(cè)量聚山梨酯80和Triton X-100。IoR在所研究的整個(gè)濃度范圍內(nèi)以高度線性測(cè)量HEPES濃度。

圖3.顯示了折射率（右手垂直軸）以及電導(dǎo)率和pH值（左手垂直軸）輸出與HEPES濃度（以mM為單位）的關(guān)系。將六個(gè)20 mM的HEPES濃度加標(biāo)添加到氯化鈉溶液中，使NaCl中的HEPES總濃度為120 mM。

圖4顯示了IoR和電導(dǎo)率與聚山梨酯80（P80）濃度的函數(shù)關(guān)系。將 P80 以 1 mL 加標(biāo)添加到 1 L NaCl 溶液中。電導(dǎo)率無(wú)法測(cè)量P80濃度。相比之下，IoR在聚山梨酯80的整個(gè)濃度范圍內(nèi)顯示出高線性。圖5顯示，IoR對(duì)Triton X-100的表現(xiàn)同樣出色，并且電導(dǎo)率無(wú)法測(cè)量Triton X-100濃度變化。

圖4.折射率和電導(dǎo)率繪制為添加到 1 升 NaCl 溶液中的聚山梨酯 80 （P80） 濃度加標(biāo)的函數(shù)。電導(dǎo)率沒(méi)有響應(yīng)，無(wú)法測(cè)量P80濃度。

圖5.折射率和電導(dǎo)率繪制為添加到 1 升 NaCl 溶液中的 Triton X-100 濃度加標(biāo)的函數(shù)。電導(dǎo)率沒(méi)有反應(yīng)，無(wú)法測(cè)量Triton X-100濃度。

表A顯示了此處研究的緩沖溶液濃度測(cè)量的IoR和電導(dǎo)率結(jié)果的摘要。折射率顯示出高線性度，能夠測(cè)量整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍的所有測(cè)試緩沖溶液。電導(dǎo)率測(cè)試方法無(wú)法測(cè)量七個(gè)緩沖過(guò)程中的五個(gè)。此外，IoR 的濃度測(cè)量精度為 ±10 ppm，而電導(dǎo)率的濃度測(cè)量精度為 ±100 ppm。

表A.緩沖溶液濃度測(cè)量的IoR和電導(dǎo)率結(jié)果摘要。

圖 6 顯示了此處評(píng)估的每種技術(shù)的 LOD 和 LOQ。這些結(jié)果表明，IoR分析儀在電導(dǎo)率、pH和滲透濃度方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于IOR分析儀，LOD和LOQ分別為0.70和2.33。電導(dǎo)率LOD和LOQ比IoR分析儀器差兩倍以上，分別為1.76和5.84。

圖6.用于 pH、電導(dǎo)率、折射率和滲透壓濃度測(cè)量的檢測(cè)限 （LOD） 和定量限 （LOQ）。

圖7顯示了培養(yǎng)基制備過(guò)程中酵母提取物的IoR分析儀和誘導(dǎo)率的比較。IoR分析儀顯示出優(yōu)異的電導(dǎo)率線性。此處評(píng)估的所有其他培養(yǎng)基制備過(guò)程均有類似的結(jié)果。

對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，使用折射率（IoR）分析儀測(cè)量的溶質(zhì)濃度在線性（通過(guò)數(shù)據(jù)生成的線的R2測(cè)量值）、精度、準(zhǔn)確度（確定的最佳最小二乘線性擬合）、動(dòng)態(tài)范圍和重現(xiàn)性方面優(yōu)于電導(dǎo)率測(cè)量。總結(jié)：

• 為了測(cè)量連續(xù)添加NaCl到恒定溶液[NaPO4]中，IoR的濃度測(cè)量表現(xiàn)出優(yōu)異的線性和精度（通過(guò)R2值測(cè)量）。

• 為了測(cè)量將 NaPO4 連續(xù)添加到常數(shù) [NaCl] 溶液中，IoR 測(cè)量表現(xiàn)出卓_越的線性度和精度（通過(guò) R2 值測(cè)量）。

• 為了測(cè)量HEPES連續(xù)添加到恒定[NaCl]溶液中，IOR的濃度測(cè)量表現(xiàn)出卓_越的線性，精密度和特異性。由于向溶液中添加HEPES的電導(dǎo)率產(chǎn)生的線斜率大部分是平坦的，實(shí)際上略有負(fù)值，因此電導(dǎo)率測(cè)量對(duì)緩沖溶液中的HEPES幾乎沒(méi)有特異性。

• 為了測(cè)量檸檬酸鈉連續(xù)添加到恒定 [NaPO4] 溶液中的測(cè)定，IOR的濃度測(cè)定顯示出遠(yuǎn)超的線性（電導(dǎo)率測(cè)量是非線性的）、精度和范圍。

• 對(duì)于連續(xù)添加聚山梨酯 80 到水中的測(cè)量，IoR 的濃度測(cè)量表現(xiàn)出卓_越的線性、精密度和特異性。

• 對(duì)于針對(duì) pH、介導(dǎo)率和滲透濃度的 LOD 和 LOQ 實(shí)驗(yàn)，對(duì)于定量限和檢測(cè)限，IoR 的靈敏度是電導(dǎo)率的 2.5 倍，是滲透濃度的 4.2 倍，是 pH 的 28.6 倍。

• 對(duì)于連續(xù)增加的復(fù)雜介質(zhì)濃度，通過(guò)IoR進(jìn)行測(cè)量表現(xiàn)出優(yōu)異的線性度和精度，生成的數(shù)據(jù)的R2值更高。

圖7.折射率 （IoR） 和電導(dǎo)率繪制為酵母提取物的函數(shù)（以克為單位）。IoR分析儀表現(xiàn)出優(yōu)于電導(dǎo)率的線性。

討論

這些實(shí)驗(yàn)表明，與pH值、電導(dǎo)率和滲透壓相比，通過(guò)折射率測(cè)量工藝流體是制藥制造中實(shí)時(shí)、在線質(zhì)量控制的可行和卓_越的手段。此外，實(shí)驗(yàn)表明，目前可用的基于IoR的設(shè)備比目前可用的測(cè)量其他流體參數(shù)（如電導(dǎo)率、滲透壓濃度和pH值）的流體測(cè)量設(shè)備表現(xiàn)出更大的線性和精度，以及更低的可檢測(cè)性和定量水平。他們還表明，與電導(dǎo)率和pH值相比，通過(guò)折射率測(cè)量顯示出更大的特異性和相關(guān)性，用于測(cè)量含有它們的任何緩沖液或生長(zhǎng)介質(zhì)中陰離子溶質(zhì)的濃度。由于非離子溶質(zhì)不影響電導(dǎo)率或pH值，因此在測(cè)量制備溶液中此類溶質(zhì)的含量時(shí)，這些特性的測(cè)量提供的信息很少。此外，含有兩性離子（偶極離子）的溶液（如HEPES）的行為是高度不可預(yù)測(cè)的;因此，使用pH和電導(dǎo)率來(lái)測(cè)量?jī)尚噪x子溶液成分的濃度也不是最佳的。這些屬性（非離子溶液和含有兩性離子（偶極離子）成分的溶液具有卓_越的精度、線性和特異性，使得折射率測(cè)量適用于制藥生產(chǎn)中必不_可少的許多緩沖液和細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量控制。

此外，IoR 也可能是驗(yàn)證發(fā)酵和分離罐的在線清洗 （CIP） 解決方案的高度相關(guān)指標(biāo)。與電導(dǎo)率的比較尤其基于對(duì)改進(jìn)實(shí)時(shí)、原位濃度監(jiān)測(cè)和控制的需求。事實(shí)上，在幾乎所有情況下，IoR都是用于濃度測(cè)量的優(yōu)于電導(dǎo)率的方法。

然而，傳統(tǒng)的IoR受到其無(wú)法指_定化學(xué)混合物的限制。因此，近紅外（NIR）和傅里葉反式紅外光譜（FTIR）等吸收光譜技術(shù)是用于復(fù)雜化學(xué)混合物的強(qiáng)大集中形態(tài)分析工具。

通過(guò) IoR 進(jìn)行測(cè)量還有其他優(yōu)勢(shì)。由于折射率測(cè)量只需要一束從工藝流體表面反射的光。因此，它有效地消除了流體采樣造成的任何潛在污染風(fēng)險(xiǎn)，或由于施加電壓電位或其他測(cè)量方式而對(duì)敏感介質(zhì)內(nèi)容物的潛在損壞。此外，折射率測(cè)量幾乎是瞬時(shí)的，而其他方法（如采樣）需要更多時(shí)間。測(cè)量折射率也更有可能減少人為誤差。

這并不是說(shuō)折射率測(cè)量與其他質(zhì)量控制指標(biāo)相比沒(méi)_有_缺_點(diǎn)。具體而言，傳統(tǒng)的IoR測(cè)量多組分流體混合物的平均濃度，并且缺乏指_定所述混合物中特定組分濃度的能力。IoR 也取決于溫度，最_先進(jìn)的 IoR 分析儀具有實(shí)時(shí)溫度補(bǔ)償作為內(nèi)置功能。不能推斷折射率測(cè)量在所有情況下都應(yīng)取代pH、電導(dǎo)率或滲透濃度的測(cè)量。相反，pH值雖然目前是一個(gè)不太準(zhǔn)確的測(cè)量指標(biāo)，但它仍然是流體的物理特性，其本身會(huì)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生非常直接的影響。溶液的滲透濃度或電導(dǎo)率也可能直接影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量;但是，并非在所有情況下都是如此。事實(shí)上，鑒于許多緩沖液和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分是陰離子的，因此，對(duì)電導(dǎo)率完_全沒(méi)有影響，因此很容易爭(zhēng)辯說(shuō)，在這種情況下，折射率將是一個(gè)與整體產(chǎn)品質(zhì)量更直接相關(guān)的指標(biāo)。

同樣，兩種非常不同的溶質(zhì)的等摩爾量可以產(chǎn)生相同的滲透壓濃度讀數(shù)，因此滲透壓濃度測(cè)量無(wú)法檢測(cè)到兩種溶質(zhì)之間的差異。這兩種不同的溶質(zhì)不太可能給出相同的滲透壓濃度讀數(shù)，也不會(huì)給出相同的IoR讀數(shù)。因此，對(duì)于許多應(yīng)用，工藝流體折射率的測(cè)量很可能可以替代其他指標(biāo)，而對(duì)于其他應(yīng)用，它更恰當(dāng)?shù)乜赡苁峭ㄟ^(guò)其他物理參數(shù)進(jìn)行測(cè)量的補(bǔ)充。在許多情況下，額外的指標(biāo)可能是保障產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的關(guān)鍵指標(biāo)。

IoR作為過(guò)程質(zhì)量控制指標(biāo)的其他應(yīng)用仍有待研究，但可能具有巨大的潛力。折射率的卓_越靈敏度可能使其在測(cè)量最終產(chǎn)品的濃度和/或質(zhì)量方面具有潛在價(jià)值。不太可能是折射率檢測(cè)內(nèi)毒素等雜質(zhì)的能力。在制藥領(lǐng)域之外，IoR也可能是一個(gè)有益的指標(biāo)。IoR 的其他應(yīng)用包括相關(guān)行業(yè)，如微芯片制造、塑料、食品加工、釀造、釀酒和化妝品。但對(duì)于所有這些應(yīng)用，IoR 將提供相同的功能——與電導(dǎo)率測(cè)量相比，具有更高的精度、精度和線性度。